Terapia epigenética

Tema: El ácido valproico como agente sensibilizador al tratamiento anticáncer

Mecanismo epigenómico tratado: Promover el aumento de la acetilación de las histonas.

Cómo se lo hizo: A partir del tratamiento con inhibidores de las HDACs (HDACi), que remueven grupos acetilo, aumentando la atracción del ADN hacia las cargas positivas de las histonas

Los principales HDACi que se están estudiando son:

Ácido Valproico (VPA), hiperacetilación de la histona H3 en distintas áreas cerebrales;
Tricostatina A, rescató de forma selectiva la fragmentación mitocondrial y muerte celular;


También están: Emodina, Entinostat, Tubastatina A, LMK235 y CL-SIRT070.

Resultados: La vasopresina (AVP) se ha empleado en el tratamiento del cáncer, detienen el ciclo celular, generan diferenciación y apoptosis en las líneas celulares cancerígenas en el humano. La capacidad de activar la expresión de Notch I, que es un supresor de tumores.

Reactiva la transcripción de genes supresores de tumores y revierte el cáncer.

Biotransformación del ácido valproico. Tomado de Correa. (2021)

Fuentes Bibliográficas:


1. Luna-Palencia Gabriela Rebeca, Correa-Basurto José, Vásquez-Moctezuma Ismael. El ácido valproico como agente sensibilizador al tratamiento anticáncer. Gac. Méd. Méx [revista en la Internet]. 2019 Ago [citado 2024 Sep 05] ; 155( 4 ): 417-422. Disponible en: https://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S0016-38132019000400417&script=sci_arttext

Técnicas de Edición de Ácidos nucléicos

 CRISPR/Cas 9 para el tratamiento de la infección por virus de la Hepatitis B

Tema: CRISPR/Cas9 para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis B

Tipo de Edición: in vivo; células somáticas (hepatocitos)

Dirigidas hacia: ADNcc (ADN acoplado en bucle cerrado) y ADN genómico integrado; del virus de la hepatitis B.

Dirigidas por: CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)

Uso de Vectores: 

• Vector no viral: nanopartículas lipídicas (LNPS).

• Vector viral: virus adenoasociados (AAV), lentivirus recombinantes (LVS)

Órgano/célula a tratar: Hígado/ Células Hepáticas

Vía de administración: Vía Intravenosa/parenteral

Resultados:

El sistema CRISPR/cas9 se evaluó por primera vez en el tratamiento del VHB en 2015. 

Para evaluar los resultados se tienen en cuenta artículos desde 2019-2020.

Corto plazo: varios estudios en ratones han demostrado una inhibición exitosa de la replicación viral y la producción de marcadores virales, como el HBsAg [1]. Además, el sistema CRIPR/cas 9 actúa de manera eficaz sobre tres regiones altamente conservadoras  en el genoma del VHB y produce la degradación del ccDNA del VIH. También existe una disminución del pgARN junto con la inhibición de las proteínas virales sin ningún efecto citotóxico [2].

Mediano plazo: La cantidad de HBsAg secretada en el cultivo celular y el suero de ratón se redujo mediante el tratamiento con CRISPR/Cas9. Los análisis inmunohistoquímicos no mostraron casi ninguna célula HBsAg-positiva en el tejido hepático de los ratones tratados con CRISPR/Cas9. [3]

Largo plazo: Se espera que el progreso general en el campo permita el silenciamiento eficaz de las transcripciones virales producidas por el ADNcc en la infección crónica por VHB. Se plante que tiene potencial para convertirse en un nuevo enfoque para lograr la cura funcional de los pacientes con infección por VHB [4].

Figura 1. Aplicación de CRISPR/Cas9 en la edición dirigida del genoma del VHB. Tomado de Chang (2023).

Bibliografía

1.	Cai B, Chang S, Tian Y, Zhen S. CRISPR/Cas9 for hepatitis B virus infection treatment. Immun Inflamm Dis [Internet]. 2023;11(5). Disponible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/iid3.866

2.

Kostyushev D, Brezgin S, Kostyusheva A, Zarifyan D, Goptar I, Chulanov V. Orthologous CRISPR/Cas9 systems for specific and efficient degradation of covalently closed circular DNA of hepatitis B virus. Cell Mol Life Sci [Internet]. 2019 [citado el 25 de agosto de 2024];76(9):1779–94. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30673820/

3.	Lv W, Li T, Wang S, Wang H, Li X, Zhang S, et al. The application of the CRISPR/Cas9 system in the treatment of hepatitis B liver cancer. Technol Cancer Res Treat [Internet]. 2021 [citado el 25 de agosto de 2024];20:153303382110452. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34605326/

4.	Fei L, Sun S, Yang Q, Huang Y, Li Q, Tao S, et al. CRISPR/Cas9 system with dual gRNAs synergically inhibit hepatitis B virus replication. Discov Med [Internet]. 2024 [citado el 25 de agosto de 2024];36(185):1169. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38926103/

Terapia con Stem Cell

Células madre adiposas humanas disminuyen el daño de fibrosis hepática

Enfermedad o condición: Fibrosis hepática

Tipo de Stem Cell: Células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de células madre adiposas humanas (CMAd-h)

 
Método de obtención:

• Con el fin de aislar CMAd-h, se obtuvo 15 gr de tejido graso de descarte posquirúrgico del epiplón menor, libre de agentes virales infectocontagiosos, la muestra fue depositada de inmediato en un medio de cultivo de transporte constituido por DMEM-F12 (Invitrogen), al cual se le adicionó 10 % de suero fetal bovino (SFB) y penicilina estreptomicina-anfotericina B
• Una vez consiguieron aislar las células madre adiposas, estas fueron sometidas a un proceso de reprogramación para obtener una iPSC, para ello se empleó el kit Flow Cellect TM Human Mesenquimal Stem Cell Characterization kit (Milipore), conteniendo los siguientes marcadores: CD105FITC, CD90PE, CD19PECy5, así como los monoclonales CD34EDC (Beckman Coulter) y CD45PECy7 (E Bioscience)
• Las iPSC se diferenciación a 4 linajes, esto se realizó mediante kits de diferenciación adipogénica, osteogénica, condrogénica y neurogénica (Invitrogen) (Kits comerciales)

Vía de administración: Parenteral (Infusión intravenosa, la dosis de células trasplantadas fue de 1x10⁶/kg por vía endovenosa empleando una jeringa de 1 mL)

 
Resultados:
A corto plazo (1 año)
Existieron cambios en los valores sanguíneos de Transaminas oxaloacetica (TGO), Transaminasa piruvica (TGP), Fosfatasa alcalina (ALP), nitrógeno ureico de la sangre (BUN), ceratinina, proteínas totales, albúmina y globulinas. Demostrando una mejora inicial del funcionamiento hepático.

A mediano plazo (3 años)
Se encontró una disminución significativa en las poblaciones de la serie blanca (leucocitos totales, linfocitos, monocitos, segmentados y eosinófilos), lo cual conlleva a una disminución en la inflamación crónica hepática.

Además, existió también una disminución significativa en los niveles de urea y BUN (p>0,005) así mismo en las transaminasas TGO y TGP (p > 0,05).

A largo plazo (5 años)
Se analizaron biopsias del tejido inicial y se las comparó con biopsias tomadas luego de 20-28 semanas del tratamiento. Se encontró que habían disminuído los macro y micronódulos que se encontraban en el tejido en un inicio. Además que los septos fibrosos que delimitaban a los micronódulos habían desaparecido.
De esta manera, se evidencia que la terapia con CMAd-h reprogramadas reducen el tejido fibroso hepático y mejoran la función del hígado.

Figura 1. Comparación de biopsias de hígado antes y después de administrar la terapia de células madre. Tomado de Enciso. (2020)

Bibliografía

1.

Enciso-Benavides N, Cisneros-Huamaní C, Rojas-Morán N, Nava-Carrión E, Pando-Mayta J, Domínguez FF, et al. Células Madre Adiposas Humanas Disminuyen el Daño de la Fibrosis Hepática con Baja Persistencia de Células Trasplantadas en Ratas. Int J Morphol [Internet]. 2020 [citado el 17 de agosto de 2024];38(5):1496–507. Disponible en: https://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717-95022020000501496

Animales transgénicos

 Ejemplo de animal transgénico

Diseño y prueba de un donante porcino humanizado para xenotransplante

1. Tipo de animal transgénico: Minipig Yucatán - knockout y knockin

• Knockout de PERV (secuencias de retrovirus endógeno porcino) y de genes de glicanos α-Gal, antígeno Sd y del glicano Nau5Gc 
• Knockin de PL15S (constructo transgénico que contiene 7 genes humanos: CD46, CD55, THBD, PROCR, CD47, TNFAIP3 y HMOX1)

 2- Método de obtención: Recombinación homóloga en células somáticas (fibroblastos de la oreja del cerdo)

• Ensamblaje del constructo transgénico con los genes humanos de interés
• Edición del genóma porcino mediante el uso de CRISPR-Cas9
• Clonación mediante transferencia nuclear de células somáticas
• Verificación de la expresión de ADN recombinante y proteínas recombinantes en los cerdos transgénicos

3. Función: En el artículo se realizó un transplante de riñón porcino en un mono cynomolgus, paraa explorar el diseño, la creación y la función a largo plazo de injertos de riñon entre diferentes especies. Además de analizar la respuesta inmune y posibles complicaciones del xenotransplante.

Figura1. Donante porcino de Yucatán diseñado para portar 69 ediciones génicas. Tomado de Jacob V. (2023)

2. Ventajas y desventajas de los animales transgénicos

Ventajas 

• Modelos de enfermedades: Los animales transgénicos permiten crear modelos animales precisos de enfermedades humanas, lo que facilita el estudio de su desarrollo, progresión y posibles tratamientos. Esto es especialmente útil para enfermedades complejas como el cáncer, el Alzheimer y el Parkinson.
• Desarrollo de fármacos: Estos animales se utilizan para probar la eficacia y seguridad de nuevos fármacos antes de su aplicación en humanos. Al modificar genéticamente un animal para que exprese una enfermedad específica, se pueden evaluar directamente los efectos de un fármaco en esa condición.
• Producción de proteínas terapéuticas: Animales transgénicos pueden ser modificados para producir grandes cantidades de proteínas humanas terapéuticas, como factores de coagulación o hormonas de crecimiento, que pueden ser utilizadas para tratar diversas enfermedades.
• Xenotransplantes: La modificación genética de animales podría permitir el uso de sus órganos para trasplantes en humanos, lo que podría resolver la escasez de donantes.
• Investigación básica: Los animales transgénicos son herramientas valiosas para investigar los mecanismos fundamentales de la biología y la genética.

Desventajas

• Bienestar animal: La creación y el mantenimiento de animales transgénicos plantean importantes cuestiones éticas sobre el bienestar animal. Algunos procedimientos pueden causar dolor y sufrimiento a los animales.
• Riesgos para la salud: Existe la preocupación de que los animales transgénicos puedan desarrollar nuevas enfermedades o que los genes modificados puedan transferirse a otras especies, con consecuencias impredecibles para el medio ambiente y la salud humana.
• Aspectos regulatorios: La creación y el uso de animales transgénicos están sujetos a regulaciones estrictas, lo que puede ralentizar el proceso de investigación y desarrollo.
• Costos: La ingeniería genética es una tecnología costosa, lo que limita el acceso a ella para muchos investigadores.
Afecta la biodiversidad: la ingeniería Genética alteraría todas las limitaciones que la propia naturaleza pone para la relación entre organismos de especies alejadas o no emparentadas. Se argumenta que la manipulación operada en un producto transgénico no solo puede afectar a la salud del ser humano que los usa o consume sino al medio ambiente (afecta a la flora cuando se trata de productos vegetales) o a la biodiversidad (por eliminar especies o invadirlas)

Bibliografía:

1.	Anand RP, Layer JV, Heja D, Hirose T, Lassiter G, Firl DJ, et al. Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation. Nature [Internet]. 2023 [citado el 28 de julio de 2024];622(7982):393–401. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37821590/

2. Lara L. Transgénesis una aproximación a sus riesgos y beneficios. 2021 [Internet]. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2709-79272021000100141

ADN recombinante

 

Ejemplo de ADN recombinante artificial y ejemplo de recombinación de ácidos nucleicos en la naturaleza

1.- Ejemplo de ADN recombinante para el diagnóstico de la Malaria.

La malaria es una enfermedad endémica en 91 países. El agente causal es el parásito del género Plasmodium, las especies más comunes son las P. vivax y P. falciparum. Estos parasitos son transmitidos a los humanos por la picadura de mosquitos del género Anopheles. Generalmente, para su diagnóstico se emplean varias técnicas que tienen baja sensibilidad, o baja sensibilidad y especificidad, como en la microscopía o detección de anticuerpos. Por ello que se emplea la tecnología del ADN recombinante para la clonación de diversas secuencias de Plasmodium y utilizarlas como controles en el diagnóstico molecular.

T: Clonacion de secuencias de Plasmodium para su uso como controles en el diagnóstico molecular

O: Obtener secuencias clonadas de P.vivax y P. falciparum para su uso como controles en la técnica de PCR para el diagnóstico de malaria.

G: ARN ribosomal de la subunidad pequeña de P. vivax 120 pb y P. falciparum 205 pb

ER: [no menciona el artículo]

EL: enzima ligasa T4

V: pGEM®-T (plásmido)

CR: Escherichia coli de la cepa XL1-Blue MRF

MTG: transformación por choque térmico (30 min 4°C, 90 seg 42°C, 2 min 4°C).

MIC: Cultivo

Detección de clonas positivas:

• PCR multiplex
• Secuenciación

Detección de proteínas recombinantes:

• Western blot
• Inmunofluorescencia indirecta (IIF)

2. Ejemplo de recombinación de ácidos nucleicos en la naturaleza

Dentro de los mecanismos de transferencia horizontal de genes, está la conjugación bacteriana. En esta, una bacteria donante va a transferir información genética de un plásmido a la bacteria receptora mediante un pili. [2]

Figura 1. Esquema de la conjugación bacteriana. Tomado de Khan Academy

1.- Pacheco C, Ferrer E, Herrera F. CLONACIÓN DE SECUENCIAS DE Plasmodium PARA SU USO COMO. [Online]; 2019. Acceso 4 de Febrerode 2024. Disponible en:https://www.researchgate.net/publication/340492225_CLONACION_DE_SECUENCIAS_DE_Plasmodium_PARA_SU_USO_COMO_CONTROLES_EN_EL_DIAGNOSTICO_MOLECULAR_CLONING_OF_Plasmodium_SEQUENCES_FOR_ITS_USE_AS_CONTROLS_IN_THE_MOLECULAR_DIAGNOSIS

2. Researchgate.net. [citado el 29 de enero de 2024]. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/332523550_CONJUGACION_BACTERIANA_Y_RESISTENCIA_A_ANTIBIOTICOS

Técnicas de hibridación

Uso de Western blot para el diagnóstico de histoplasmosis en pacientes con VIH/SIDA 

La histoplasmosis es una infección fúngica frecuente en pacientes con VIH/SIDA, con altas tasas de morbimortalidad cuando el diagnóstico y el tratamiento se retrasan. La investigación evaluó el papel de Western blot para la detección de anticuerpos contra los antígenos de Histoplasma Capsulatum en muestras de sangre y orina. Los resultados se obtuvieron mediante la visualización de bandas correspondientes a los anticuerpos contra los antígenos H y M. Todos los pacientes que presentaron histoplasmosis pulmonar diagnosticada con anterioridad, también tuvieron resultados positivos en la Western blot. Se concluyó que esta técnica molecular podría ser útil para el diagnostico de histoplasmosis en pacientes con producción de anticuerpos dificultada [1].

Figura 1. Demostración de la reactividad sérica de pacientes contra el antígeno de Histoplasma Capsulatum mediante Wastern blot. Tomado de: Almeida, Muniz y Damasceno (2019).

Bibliografía

1. Almeida MA, Damasceno LS, Pizzini CV, Muniz MM, Almeida-Paes R, Zancopé-Oliveira RM. Role of western blot assay for the diagnosis of histoplasmosis in AIDS patients from a National Institute of Infectious Diseases in Rio de Janeiro, Brazil. Mycoses. 2019;62(3):261-267. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30561870/

Técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Tema: Realización de un ensayo de PCR cuantitativa en heces para el diagnóstico de tuberculosis en adolescentes y adultos: un estudio multinacional prospectivo de precisión diagnóstica
Objetivos: Evaluar la precisión diagnóstica y el rendimiento aditivo de un nuevo ensayo de PCR cuantitativa en heces (qPCR) para el diagnóstico de tuberculosis en tres países de África.
Muestra biológica: heces (mínimo 5g)
Tipo de ácido nucleico: ADN circular relajado (4,4 millones de pares de bases)
Extracción del ADN: kit MP FAstDNA for Soil (Mp Biochemicals, Santa Anna, CA, EEUU)
Gen a amplificar: IS6110 M (gen de la tuberculosis) 1361 pares de bases
Tipo de PCR: qPCR en tiempo real

Visualización: Fluorescencia. (La fluorescencia es captada durante los ciclos por el equipo Quant Studio Machine)

Figura 1. Relación entre medidas semicuantitativas del umbral del ciclo regustradas en heces mediante qPCR y Xpert Ultra. Se comparan los resultados de ambas técnicas. Tomado de Kay, Carratala y Mendez (2024)

Bibliografía
1. Kay A, Vasiliu A, Carratala-Castro L, Mtafya B, Mendez Reyes JE, Maphalala N, et al. Performance of a stool-based quantitative PCR assay for the diagnosis of tuberculosis in adolescents and adults: a multinational, prospective diagnostic accuracy study. Lancet Microbe [Internet]. 2024 [citado el 17 de junio de 2024];5(5):e433–41. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38461830/
2. Mycobacterium tuberculosis [Internet]. NCBI. [citado el 17 de junio de 2024]. Disponible en:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/taxonomy/1773/

Alteraciones en la epigenética en el Lupus Eritematoso Sistémico

El rol de la epigenética en enfermedades autoinmunes/inflamatorias

La enfermedad autoinmune/inflamatoria sistémica “Lupus Eritematoso Sistémico” (LES) presenta autoanticuerpos y linfocitos autorreactivos. Si bien la fisiopatología del LES no se comprende por completo, se ha encontrado que existen alteraciones epigenéticas implicadas. Por ejemplo, en los linfocitos T CD4+ se encontraron regiones de hipometilación de ADN en genes que codifican para IL-10 e IL-3. Además, la expresión de micro ARN, en específico miR-21, son factores que contribuyen al aumento de producción de IL-10 [1].

Figura 1. Mecanismos epigenéticos que contribuyen a la desregulación de las respuestas inmunes innatas y adaptativas en el lupus eritematoso sistémico. Tomado de Surace y Hedrich (2019).

Bibliografía

1. Surace AEA, Hedrich CM. The role of epigenetics in autoimmune/inflammatory disease. Front Immunol [Internet]. 2019 [citado el 9 de junio de 2024];10. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31333659/

Alteraciones en la traducción de proteínas

Distintos roles que S6K1 y S6K2 ejercen sobre mTOR en el cáncer de mama

mTOR (mecanicista de rapamicina) es un regulador en la traducción de las proteínas además de desempeñar un papel importante en la tumorigénesis, sin embargo, se encuentra alterado en el cáncer de mama. Se ha visto que la función de mTOR1 esta mediada por la proteína ribosómica S6. A su vez, esta proteína es fosforilada por S6K.

Se descubrió que S6K1 y S6K2 están sobreexpresados en el cáncer de mama. En específico S6K2 se relaciona con la proliferación de células cancerígenas. Mientras que S6K1 interviene en la migración e invasión del cáncer. [1].



Figura 1. La activación del objetivo mecanicista de la rapamicina (mTOR). Tomado de Sridharan S. (2020)








Bibliografía

1. Sridharan, S., & Basu, A. (2020). Distinct Roles of mTOR Targets S6K1 and S6K2 in Breast Cancer. International journal of molecular sciences, 21(4), 1199. Disponible en:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32054043/

Alteraciones en la transcripción genética del Alzheimer

 

Cambios epigenéticos y reorganización de la cromatina en la función cerebral: lecciones del conjunto de memoria del miedo y la enfermedad de Alzheimer

El artículo menciona factores que podrían alterar la transcripción genética normal, como cambios en las marcas de las histonas o en la arquitectura de la cromatina 3D. En específico, el estudio muestra que un aumento en la metilación de la histona H3K9 puede contribuir significativamente en la represión transcripcional de los genes indispensables de neuroplasticidad, lo cual promueve el deterioro cognitivo y el aparecimiento del Alzheimer. Sin embargo, el estudio también sugiere que un tratamiento con epifármacos específicos podría revertir el deterioro de la memoria [1].

Imagen 1. Alteraciones locales en el epigenoma. van Zundert y Montecino. 2022. Obtenido de: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36292933/

Bibliografía

1. van Zundert B, Montecino M. Epigenetic Changes and Chromatin Reorganization in Brain Function: Lessons from Fear Memory Ensemble and Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences [Internet]. 2022 Oct 11 [citado 2024 May 26]; 23(20):12081. Disponible en:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36292933/

 

Alteraciones genómicas en el cáncer de próstata neuroendocrino

El cáncer de próstata neuroendócrino es uno de los subtipos de cáncer más agresivos; por ello, el identificar los genes implicados y sus mecanismos moleculares ayuda a dar un tratamiento más específico. El gen TP53 es el que muta con mayor frecuencia en esta enfermedad. Se ha encontrado que el tipo de mutación es una alteración en el número de copias de dicho gen, específicamente la deleción. Además, muchas veces la ausencia de este gen es acompañada de la inactivación de PTEN y RB1; genes que codifican para proteínas supresoras de tumores [1].

Referencias bibliográficas:

1. Zhang Q, Han Y, Zhang Y, Liu D, Ming J, HUang B, Qiu X. Treatment-Emergent Neuroendocrine Prostate Cancer: A CLinicopathological and Inmunohistochemical Analysis of 94 Cases. Front Oncol. 2021 Feb 1; 10:571308. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10071089/

Bienvenida

Sean bienvenidos a mi blog. Les saluda Adriana Aguirre, estudiante de medicina. Este es un espacio donde hablaremos de biología molecular. Trataré de hacer un blog de lo más interactivo posible para facilitar la comprensión de los temas. Espero les guste y podamos divertirnos en el proceso.